一、玫瑰花环试验原理
动物T淋巴细胞表面具有结合异种动物红细胞的受体，称为E受体，在体外一定条件下，能与绵羊等动物的红细胞结合，形成以T细胞为中心，红细胞环绕在四周，宛似一朵玫瑰花样的花环，故取名为E玫瑰花环试验（erythrocyte rosettes assay）或自然花环形成试验。凡能与RBC形成E花环的淋巴细胞称E花环形成细胞（Erosette forming cell，ERFC）。目前公认绵羊红细胞（SRBC）受体是人、骡、牛、山羊、猪等T淋巴细胞的特异标志，ERFC就是T细胞。这种玫瑰花环形成不需任何物质的刺激，故也称自然玫瑰花环形成试验。
在E玫瑰花环形成试验中，当一定比例的淋巴细胞与绵羊红细胞混合后，不放置冰箱中孵育，早期离心、镜检，可见一部分T细胞与SRBC形成玫瑰花，称之为“活性玫瑰花（active rosette）”，或称为“早期玫瑰花（early rosette）”；而放置低温4℃孵育后，形成的玫瑰花称为总玫瑰花（total rosette）或晚期玫瑰花（late rosette）。
早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数目的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和尽对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T淋巴细胞的最常用方法之一。
二、玫瑰花环试验材料、方法及结果
（一） 材料
1 抗凝剂200u/ml肝素生理盐水溶液或38%柠檬酸钠液。
2 豚鼠抗凝血及家兔脱纤血或阿氏液保存的血液。
3 淋巴细胞分层液比重为1077～1078（或1082～1084）。
4 吸收灭活小牛血清小牛血清56℃ 30min灭活后，取2体积的小牛血清，加1体积存积的家兔红细胞，混匀，置37℃水浴30min，离心沉淀，吸取上清液，4℃冰箱保存。
5 无钙镁Hanks液，pH值74。
6 固定剂08%戊二醛。
7 染液配制方法：
Ⅰ液瑞氏粉01g，甲醇60ml，研碎混匀。
Ⅱ液姬姆萨氏粉05g，纯甘油33ml，甲醇33ml，先将姬姆萨氏粉溶于甘油中，并置60℃温箱中（或水浴中保温15～2h），最后加甲醇即可。
使用时，分别将Ⅰ液和Ⅱ液用pH值64 PBS稀释1倍。
（二） 方法
1 1%家兔红细胞悬液的制备取家兔脱纤血或阿氏液保存的血液，以Hanks液洗三次，2000 r/min离心10min后，将压积红细胞用Hanks液配成1%悬液，含红细胞数约为1×108/ml。
2 豚鼠淋巴细胞的分离取肝素抗凝血10ml，加等量Hanks液稀释后，用毛细吸管沿管壁缓缓加进装有淋巴细胞分层液的试管内，使血液重叠于分层液上，用水平离心机以2，000 r/min离心30min。此时红细胞沉降至最下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一白色狭带为淋巴细胞和单个核细胞层（图3161）。用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于离心管中，用Hanks液洗涤，1 000 r/min离心10min，反复1次，最后用Hanks液配成1×107个细胞/ml浓度的细胞悬液。必要时可用台盼蓝试验进行存活率检查，应在95%以上（活细胞不着色）。
3 玫瑰花环形成试验取上述淋巴细胞悬液03ml，加进1%家兔RBC 03ml及灭活小牛血清01ml，混匀，37℃水浴保温25min，取出以500 r/min离心5min，弃上清，留少许液体，即可用此细胞液涂片或滴片进行观察，此时见到的玫瑰花环即为活性玫瑰花（Ea）。
如将此细胞液置4℃冰箱中作用2h（或过夜）取出后，再加进08%戊二醛2滴，轻轻旋转试管，使沉淀的细胞重新悬浮，用毛细管轻轻混匀。此时观察到的玫瑰花环为总玫瑰花（Et）。
4 制片、镜检及结果
（1） 湿片：取上述细胞液一滴加于事先展有瑞氏染液的玻片上，覆以盖玻片，在高倍镜下观察，凡吸附4个或更多家兔红细胞的单核细胞，为RE花环形成细胞，共计数200个细胞，算出百分率。
（2） 干片：取培养物1滴于载玻片上，涂片、干燥，滴加甲醇固定5min，用pH值64 PBS冲洗，加Ⅰ液染4min，冲洗，再加Ⅱ液染4min，冲洗，待干，镜检。红细胞染成红色，淋巴细胞染成蓝色。可见淋巴细胞四周吸附有不同数目的红细胞，呈玫瑰花环状。
三、玫瑰花环试验留意事项
1 试验用家兔红细胞要新鲜，最好采血后当天使用，但阿氏液保存的血液也不宜超过两周。 

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